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大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)酶聯免疫

     檢測試劑盒使用說明書        AE91758Ra

   使用前仔細閱讀本說明書。本酶聯免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理，來檢測大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)，只能用于研究用途，不得用于醫學診斷。

用   途：用于大鼠血清、血漿及相關液體樣本中蛋白質修補同系物（PTCH)測定。

工作原理:

本試劑盒采用的是生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）測定樣品中大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)水平。向預先包被了大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)，溫育；溫育后，加入生物素標記的抗蛋白質修補同系物（PTCH)抗體。再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠蛋白質修補同系物（PTCH)的濃度呈正相關。

試劑盒組成 

需要而未提供的試劑和器材

1. 37℃恒溫箱。
2. 標準規格酶標儀。
3. 精密移液器及一次性吸頭
4. 蒸餾水，
5. 一次性試管
6. 吸水紙

注意事項

1. 從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差
3. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
4. 為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。
5. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
6. 底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標本要求 

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

操作程序

1. 標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)

   800 ng/L	5號標準品	120μl的原倍標準品加入120μl標準品稀釋液
   400 ng/L	4號標準品	120μl的5號標準品加入120μl標準品稀釋液
   200 ng/L	3號標準品	120μl的4號標準品加入120μl標準品稀釋液
   100 ng/L	2號標準品	120μl的3號標準品加入120μl標準品稀釋液
   50 ng/L	1號標準品	120μl的2號標準品加入120μl標準品稀釋液

2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。
3. 加樣：1）空白孔，空白對照孔不加樣品，生物素標記的抗PTCH抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同；2）標準品孔：加入標準品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物素抗體，故不加)；3）待測樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗PTCH抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。
4. 配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘. 
7. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
8. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。
9. 根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。

操作程序總結：

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.92以上。

2.批內與批間應分別小于9%和15%

檢測范圍：

檢測范圍：25 ng/L -900 ng/L

保存條件及有效期：

保存：2-8℃。

有效期：6個月(2-8℃)。