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      ELISA 測定操作規(guī)程
    2. 發(fā)布日期:2011-10-24      瀏覽次數(shù):1323
      • ELISA測定操作規(guī)程(以小鼠TNF-a為例)

        一、原理與意義

        通過抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象,對樣品中的抗原或抗體進行定性和定量檢測。本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA,用抗小鼠TNF-a單抗包被于酶標板上,標準品和樣品中的TNF-a與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗小鼠TNF-a抗體,形成免疫復合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin)與生物素結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺(OPD),出現(xiàn)黃色,加終止液濃硫酸,顏色變深,492nm處測OD,TNF-a濃度與OD值成正比,可通過繪制標準曲線求出標本中TNF-a濃度。它是樣品中蛋白質(zhì)含量檢測的定性和定量方法。

        二、試劑盒的組成

        96/48微孔板(1,已包被抗小鼠TNF-a單抗、樣品稀釋液(1、*抗體工作液(1、酶標抗體工作液(1、底物稀釋液(1、終止液(1、洗滌液(20×,1、標準品(2000 pg/ml,2,凍干粉OPD(3、坐標紙(1。

        三、實驗準備工作

        1、試劑配制:洗滌液按1:20三蒸水稀釋;標準品在用前每管加入200 ?l蒸餾水溶解即可具體見說明書);底物工作液應在顯色前5-10 minOPD片放入底物稀釋液中溶解,每片加5 ml液。

        2、標本收集:采集血清或體液盡早檢測,2~8 保存一天需更長時間須冷凍(-20保存,避免反復凍融;組織胎肝、胎腦等實驗前一天組織勻漿,90%體積RIPA裂解液(PH 8.0,50 mM Tris HCl、1% NP-40、,0.25% sodium deoxycholate150 mM NaCl、1 mM EDTA)10%體積的10 mM PMSF進行組織勻漿(10%),冰上裂解30 min,12000×20min后取上清,4待用。

        3、器材準備:酶標儀、37 恒溫烤箱、濾紙、托盤、量筒、燒杯、各種規(guī)格的移液器、離心管、管架和廢液缸等。三蒸水自備。

        四、操作步驟

        1、設立標準孔8根據(jù)樣品蛋白濃度可調(diào)整為6),每孔中先各加入樣品稀釋液100 ul,*孔再加標準品100 ul,混勻后用移液器吸出100 ul,移至第二孔,如此反復作對倍稀釋至第7,zui后,從第7孔中吸出100 ul棄去,使之體積均為100 ul。第8孔為空白對照。

        2、加樣:待測樣品孔中每孔各加入待測樣品100ul。

        3、將反應板置于37 ×120 min

        4、洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4-6,向濾紙上扣干。

        5、每孔中加入*抗體工作液50ul。

        6、將反應板充分混勻后置37 ×60 min

        7、洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4~6,向濾紙上扣干。

        8、每孔加酶標抗體工作液100ul。

        9、將反應板置于37  120 min。

        10、洗板:用洗滌液將反應板充分洗滌4~6,向濾紙上扣干。

        11、每孔中加入底物工作液100ul, 置于37 暗處反應5~10 min。

        12、每孔中加入50ul終止液混勻。

        13、用酶標儀在492 nm處測吸光值。

        五、計算結(jié)果與判斷

        1、以標準品 1000500、250125、62.5、31.25、15.625、0 pg/mlOD值在半對數(shù)紙上作圖,畫出標準曲線。

        2、所有OD值都應減去空白管值后再計算。

        根據(jù)樣品OD值在該標準曲線圖上查出或根據(jù)標準曲線公式換算出相應樣品中TNF-a含量。

        六、注意事項

        1、以上標準孔及待查樣品均建議做復孔,每次測定均要做標準孔。

        2、本試劑盒宜置-20 冷藏保存。

        3、本試劑盒取出的試劑在室溫(20~25 環(huán)境下使用,溶液應輕輕搖勻后使用。

        4、本試劑盒含2M硫酸,不要將它與含*的廢物混在一起。

        5、板條開封后剩余板條要再封好,保持板條干燥。

        6、避免交叉污染。如洗滌時向樣品待測蛋白含量可能高的一側(cè)傾倒。

        7、提前24 h打開烤箱預熱。

        8、底物工作液應在顯色前5~10 min配制。若配制時間過長,會變質(zhì)。

        9、甩盡孔內(nèi)液體,每孔加350 ul左右洗滌液,靜止30 s后甩盡。尤其加抗體工作液或底物時盡量弄干孔內(nèi)液體。且孵育過程中要蓋住各反應孔,防止液體恢復。

        10、盡量防止樣品待測蛋白濃度過高而出現(xiàn)酶標儀顯示out。當酶標儀測定值出現(xiàn)許多out,可通過稀釋一定倍數(shù)后用可見光分光計測定,所有孔均同時測定。

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