酶結合物的制備

    免疫酶技術（immunoenzymatic technique）又稱酶免疫測定法（enzyme immunoassay,EIA）,是繼免疫熒光技術和放射免疫技術之后發展起來的又一種免疫標記技術。它是把抗原抗體的特異性反應和酶的催化作用相結合而建立的。該技術通過化學方法將酶與抗體或抗抗體結合，形成酶標記物，這些酶標記物仍保持免疫學活性和酶的活性，然后將它與相應的抗體或抗原起反應，形成酶標記復合物，結合在免疫復合物上的酶，在遇到相應的底物時，則催化底物產生水解、氧化或還原等反應，而生成可溶性或不溶性有色物質。然后根據顯色的深淺來反映待測樣品中抗原或抗體的含量，如生成的有色物質為可溶性，則可用肉眼比色或酶標測定儀測定光密度值（OD）定性或定量；如生成的有色物質為不溶性沉淀物，同時又是電子致密物質，則可用光學顯微鏡或電子顯微鏡識別和定位。因此，免疫酶技術是一項定位、定性和定量（敏感度可達每毫升ng~pg水平）的綜合技術。常用的酶是辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）。

    酶標抗體或抗抗體（抗免疫球蛋白）結合物可采用戊二醛法或過碘酸鹽氧化法制備。郭春祥建立的辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用于實驗室的小批量制備。現將操作方法介紹如下： 

    （一） 結合物的標記將5mg HRP溶于05ml蒸餾水中，加入新配制的006mol/L NaIO4水溶液05ml，混勻，置冰箱30min，取出加入016mol/L乙醇水溶液05ml，室溫放置30min后，加入含5mg純化抗體的水溶液（或PBS）1ml，混勻并裝透析袋，以005mol/L、pH值95碳酸鹽緩沖液緩慢攪拌透析6h（或過夜）使之結合，然后吸出加NaBH4溶液（5mg/ml）02ml，置冰箱2h。將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨，冰箱放置30min，離心，將所得沉淀物溶于少許002mol/L、pH值74 PBS中，并對之透析過夜。次日再離心除去不溶物，即得酶抗體結合物。用002mol/L、pH值74 PBS加至5ml，進行測定后，冷凍干燥或低溫保存。 

    （二） 結合物中HRP與抗體量的測定酶標結合物于751型分光光度計上分別用280及403nm波長測定其光密度（OD），并計算出OD403與OD280之比值以及HRP與抗體的mol/L比。

結合物中HRP濃度（mg/ml）=OD403×04 

結合物中IgG濃度（mg/ml）=（OD280-OD403×03）×062 

酶/抗體mol/L比=HRP濃度IgG濃度×4 

    （三） 結合物稀釋度的測定

用酶結合物中抗體相應的抗原直接包被聚苯乙烯反應板，采用ELISA直接法測定酶結合物效價。通常本法制備的酶結合物作1∶10 000稀釋時，其OD403仍在01以上。